感受态细胞的制备
感受态细胞的概念感受态，指的是细菌在一定的条件下可以吸收外部环境中的DNA的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和成功转化的关键。AGL1感受态细胞实验原理：目前,感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌,从而获得感受态细菌.此时细菌膨胀成球形,外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面,通过热激作用促进细胞对DNA的吸收.转化效率可达106-107转化子/微克DNA。注意：本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期,实验操作必须在低温下进行。具体操作：1、取-70℃冰冻菌种,用划线法接种细菌于培养皿,做好标记,于37℃培养过夜。2、第二天,从平板上挑取单个菌落,接种至含有3mlLB培养液的试管中,37℃振荡培养过夜.次日取菌液1ml接种至含有100mlLB培养基500ml烧瓶中,37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）。3、当菌落600nmOD值达到0.3-0.4时,将烧瓶取出放置冰上10~15分钟.在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中.4℃,4000g离心10分钟。4、弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液.加10ml0.1MCaCl2到离心管中,振荡混匀,悬浮菌体,冰浴30分钟。5、4℃,4000g离心10分钟,弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液.加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体.每管0.2ml分装,至4℃保存备用,24-48小时内使用效果较好.如果暂时不用,可再保存于-70℃的低温冰箱中。
感受态细胞的制备方法是什么？
感受态细胞制备常用方法是CaCl2法。感受态细胞：是指用理化方法诱导细胞，吸收周围环境中的DNA分子，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。CaCl2法制作感受态细胞的步骤：1.将大肠杆菌DH5a感受态细胞接种于普通LB平板上, 37℃恒温培养箱培养12-16h,挑取单个菌落，接种至10 mLLB普通肉汤中，37空气摇床震荡培养过夜。2.取0.25 mL过菌液，加入25 mL37℃预热的LB培养基中，扩大培养2-3h,使细菌生长至对数期(此时测定细菌培养液OD600为0.5左右)。3.转移至50mL离心管，冰上静置30 min后4000 r/min,离心10 min,倒掉液体,倒置lmin,加入5 mL预冷的0.1 mol/LCaCl2重悬管底细胞。4.然后再次冰浴30min后4000r/min离心10min,倒掉液体，倒置lmin,再次加入1 mL预冷的0.1 mol /L CaCl2,悬浮细胞沉淀，冰上分装成100uL/管，4℃沉淀过夜，吸掉上清50μL，加入50μL 50%的甘油，-70"C 保存备用。制作原理：通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。以上内容参考：百度百科-感受态细胞
电转化感受态细胞步骤
电转化感受态细胞步骤如下所示：1、由-80摄氏度冰箱中保存的菌落划单菌落，过夜培养大约16-20小时，将新鲜的单菌落接种于5ml的SOB培养基的试管中，在37摄氏度180r/min震荡培养过夜。2、取培养物500微升转接入含50mlSOB培养基的500ml摇瓶中，在200r/min37摄氏度下振荡培养至OD600约为0.5，将细菌培养物置于冰水混合物中骤冷半小时。3、用预冷的50ml离心管于4摄氏度5000r/min下离心五分钟，再收集菌体，将上清液弃去。4、用预冷的水轻轻重悬菌液，先加入少量水重悬菌体，然后把水加满，在4摄氏度5000r/min下离心五分钟，弃上清液。5、再用10%甘油重复步骤四两遍，在4摄氏度5000r/min下离心五分钟，最后一次倒尽上清液后，用残存管底的甘油悬浮细胞。6、分装100微升到数个Eppendorf管中，然后放入液氮中进行中速冻，并保存于-80摄氏度下的冰箱中。
电转化感受态细胞原理
电转化感受态细胞原理如下：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA；对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1、前夜接种受体菌（DH5a或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜。2、取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600＝0.6（约2.5-3小时）。3、将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作。注意的事项细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5a菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；所有操作均应在无菌条件和冰上进行。
