核酸分子杂交的探针
若杂交的目的是识别靶DNA中的特异核苷酸序列，这需要牵涉到另一项核酸操作的基本技术─探针（probe）的制备。探针是指带有某些标记物（如放射性同位素32P，荧光物质异硫氰酸荧光素等）的特异性核酸序列片段。若我们设法使一个核酸序列带上32P，那么它与靶序列互补形成的杂交双链，就会带有放射性。以适当方法接受来自杂交链的放射信号，即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别。在现代分子生物学实验中，探针的制备和使用是与分子杂交相辅相成的技术手段。核酸分子杂交作为一项基本技术，已应用于核酸结构与功能研究的各个方面。
[create_time]2016-05-28 19:15:46[/create_time]2016-06-10 18:17:54[finished_time]1[reply_count]2[alue_good]萌小殇9642[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.380bf4ed.cb4rYJLVXmthDPSrECCj2w.jpg?time=3662&tieba_portrait_time=3662[avatar]TA获得超过108个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]541[view_count]分子杂交技术的核酸探针标记法
核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。材料： 待标记的DNA。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。(2)未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4单位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。(7)10mol/L NH4Ac。操作步骤:(1) 按下列配比混合:未标记的dNTP 10μl10×切口平移缓冲液 5μl待标记的DNA 1μg[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μlE.coli DNA聚合酶 4单位DAN酶 I 1μl加水至终体积 50μl(2) 置于15℃水浴60分钟。(3) 加入5μl EDTA终止反应。(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。[注意]1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。材料：待标记的DNA片段。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。(2)10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。(3)Klenow片段。(4)20mmol/L DTT。(5)未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。(7)缓冲液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5% SDS。操作步骤:(1) 200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。(2) 与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物:20mmol/L DTT 1μl未标记的dNTP溶液 1μl10×随机标记缓冲液 1μl[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μlddH2O 1μl(3) 将步骤(1)eppendorf管中的溶液移到步骤(2)管中。(4) 加入5单位(约1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。(5) 在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。 用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:(1) 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; (2) 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。1. 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。材料：已制备好的单链DNA模板（方法参见第十章中有关内容）。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)10×Klenow缓冲液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris·Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。(2)0.1mol/L DTT溶液。(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。(4)40mmol/L和20mmol/L的未标记的dNTP溶液。(5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。(6) Klenow片段（5单位/ml）。(7)适宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。(8)0.5mol/L EDTA （pH8.0）。操作步骤：(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：单链模板（约0.5pmol） 1mg适当引物 5pmol10×Klenow缓冲液 3ml加水至 20ml(2)将eppendorf管加热到85℃ 5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37℃；(3)依次加入：DTT 2ml[a-32P]dATP 5ml未标记的dATP 1mldGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。(4)加1ml（5单位）Klenow酶室温下30分钟。(5)加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。(6)68℃加热10分钟，使Klenow片段失活。调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。(7)加入20单位限制性内切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1小时。(8)酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度10mmol/L。(9)用电泳方法分离放射性标记的探针。2. 从RNA合成单链cDNA探针 cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。 材料：已提纯的RNA或mRNA设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)合适的引物：随机引物或oligo(dT)15-18。(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。(4)反转录酶(200000单位/ml)。(5)100mmol/L DTT。(6)250mmol/L MgCl2。(7)1mol/L KCl。(8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)。(9)10% SDS。(10)RNasin(40单位/ml)。操作步骤:(1)在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：RNA或mRNA 10.0ml合适的产物(1mg/ml) 10.0ml1mol/L Tris·Cl(pH7.6) 2.5ml1mol/L KCl 3.5ml250mmol/L MgCl2 2.0ml5mmol/L dNTP 10.0ml[a-32P]dCTP 10.0ml0.1mol/L DTT 2.0mlRnasin 20U加水至 48ml反转录酶(200000单位/ml) 2ml混匀后,稍稍离心，37℃保温2小时。(2) 反应完毕后加入下列试剂： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保温30分钟以水解RNA。(4) 冷却至室温后, 加入10ml 1mol/L Tris·Cl (pH7.4)。混匀。然后加入3ml 2mol/L HCl。(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。 [注意] RNA极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC处理后，灭菌备用。 现以Klenow片段标记3'末端为例说明末端标记的方法。1、材料：待标记的双链含凹缺3'末端的DNA。2、设备：高速台式离心机，水浴锅等。3、试剂：(1)3种不含标记的dNTP各为200mmol/L。(2)合适的限制酶。(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。(4)Klenow片段(5U/ml)。(5)10×末端标记缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。4、操作步骤：(1)25μl反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。(2)按下列成分加入试剂并混匀： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端标记缓冲液 5ml 2mmol/L 3种dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 适量 加水至 50ml(3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。(4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15分钟。(5)70℃加热5分钟,终止反应。(6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。[注意]1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该酶进行交换反应标记5'末端。 利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。1、材料：待标记的寡核苷酸(10pmol/μl)。2、设备：高速离式离心机，恒温水浴锅等。3、试剂：(1)10×T4多核苷酸激酶缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT, 1mmol/L Spermidine·HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。(3)T4多核苷酸激酶（10单位/ml）。4、操作步骤：(1)100ng寡核苷酸溶于30ml水中。置65℃变性5分钟，迅速置冰溶中。(2)立即加入下列试剂：10×激酶缓冲液 5ml[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10mlT4多核苷酸激酶 2ml加水至 50ml混匀后置37℃水浴20分钟。(3)再加入20单位T4多核苷酸激酶，置37℃水浴20分钟后立即置冰浴中。(4)Sephadex G-50柱层析。此方法是在每个探针的5'末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA的杂交。因此，建议使用Klenow DNA聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。除了常见的同位素标记探针外，还有利用非同位素标记探针和杂交的方法，许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。 许多载体如pBluescript, pGEM等均带有来自噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA探针。RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是： RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。 RNA:RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制,所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。噬菌体依赖DNA的RNA聚合酶所需的rNTP浓度比Klenow片段所需的dNTP浓度低,因而能在较低浓度放射性底物的存在下,合成高比活性的全长探针。 用来合成RNA的模板能转录许多次,所以RNA的产量比单链DNA高。并且用来合成RNA的模板能转录多次，可获得比单链DNA更高产量的RNA。反应完毕后，用无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理,即可除去模板DNA,而单链DNA探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA分离。另外噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶不识别克隆DNA序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高,故在异常位点起始RNA合成的比率很低。因此,当将线性质粒和相应的依赖DNA的RNA聚合酶及四种rNTP一起保温时,所有RNA的合成,都由这些噬菌体启动子起始。而在单链DNA探针合成中,若模板中混杂其他DNA片段,则会产生干扰。但它也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA，它对RNase特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。
[create_time]2018-10-16 08:56:47[/create_time]2016-06-08 03:37:12[finished_time]1[reply_count]5[alue_good]匿名用户[uname]https://iknow-base.cdn.bcebos.com/yt/bdsp/icon/anonymous.png?x-bce-process=image/quality,q_80[avatar][slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]3067[view_count]分子杂交名词解释是什么?
分子杂交名词解释：不同的DNA片段之间，DNA片段与RNA片段之间，如果彼此间的核苷酸排列顺序互补也可以复性，形成新的双螺旋结构。这种按照互补碱基配对而使不完全互补的两条多核苷酸相互结合的过程称为分子杂交。分子杂交技术：作为探针的已知DNA或RNA片段一般为30～50核苷酸长，可用化学方法合成或者直接利用从特定细胞中提取的mRNA。探针必须预先标记以便检出杂交分子。标记方法有多种，常用的为同位素标记法和生物素标记法。杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。使单链DNA或 RNA分子与具有互补碱基的另一DNA或RNA 片断结合成双链的技术。即核酸分子间的杂交。相互杂交的两种核酸分子间有时并非完全一致，但必有一定的相关性。早在1961年有人创建了DNA与RNA间的分子杂交，但至70年代才发展成基因分析中一种重要的分析技术，可鉴定基因的特异性。例如可将具有一定已知顺序的某基因的 DNA片段，标上放射性核素，构成核酸探针，将它通过分子杂交与缺陷的基因结合，产生杂交信号，从而把缺陷的基因显示出来，借此可对许多遗传性疾病进行产前诊断。现又用核酸分子杂交技术诊断乙型肝炎，以及研究其他病毒性疾病和癌瘤的基因结构（癌基因）等。
[create_time]2022-01-06 14:22:47[/create_time]2022-01-07 16:50:41[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]生活小能手145[uname]https://pic.rmb.bdstatic.com/bjh/1123adfe8fa9e6d40b48fdf3a3b1d526.jpeg[avatar]极简生活，治愈生活。[slogan]极简生活，治愈生活。[intro]2159[view_count]分子杂交名词解释是什么?
分子杂交名词解释：确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。杂交技术双链，则须先变性成为单链，结合到硝酸纤维素膜上，然后与溶液中的标记探针进行杂交。通过与电泳法和放射自显影法结合，获得杂交图谱，再进行定性或定量分析。分子杂交方法广泛用于生物化学、分子生物学中作为核酸片段碱基序列的检测与鉴定手段。在医学领域中已用于某些病毒或细菌引起的感染性疾病的诊断。它也可用于基因工程。不同来源蛋白质的亚基结合过程也可称为杂交。
[create_time]2021-11-25 17:06:51[/create_time]2021-11-25 10:57:22[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]八卦娱乐分享[uname]https://iknow-pic.cdn.bcebos.com/0b7b02087bf40ad1d936a571452c11dfa8ecce56?x-bce-process%3Dimage%2Fresize%2Cm_lfit%2Cw_450%2Ch_600%2Climit_1%2Fquality%2Cq_85[avatar]开开心心聊八卦娱乐。[slogan]开开心心聊八卦娱乐。[intro]2125[view_count]什么叫核酸的分子杂交，此技术有何应用
核酸的分子杂交是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。
临床意义：
针对白领族长期紧张工作状态引起的脂肪肝、肥胖症、高血脂、心血管病等慢性病进行健康筛查，及早发现潜在的危害健康危险因素，同时提出全面健康改善方案 异常结果： 各种病原微生物感染导致的病症以及各种不健康症状。 需要检查的人群：有各种病原微生物感染者、肿瘤或者癌症患者。
[create_time]2016-05-08 20:17:16[/create_time]2016-05-23 18:43:56[finished_time]2[reply_count]0[alue_good]晴晴aml[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/public.1.144b7aea.JyJuyoDw1X9xn_k1b0-WYg.jpg[avatar]知道合伙人教育行家[slogan]乐于助人！愿意分享自己知识和观点来解决网友的困惑！[intro]1789[view_count]
下列关于核酸分子杂交的叙述，正确的是
下列关于核酸分子杂交的叙述，正确的是
A.可发生在不同来源的DNA和DNA链之间
B.可发生在不同来源的DNA和RNA链之间
C.DNA变性与复性的性质是分子杂交的基础
D.杂交技术可用于核酸结构与功能的研究
正确答案：可发生在不同来源的DNA和DNA链之间；可发生在不同来源的DNA和RNA链之间；DNA变性与复性的性质是分子杂交的基础；杂交技术可用于核酸结构与功能的研究
[create_time]2022-12-12 19:11:05[/create_time]2022-12-22 12:23:30[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]努力的小黄2333[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.d8f4ece6.WYn6_ZldLmI5OmNPEH5p3g.jpg?time=7426&tieba_portrait_time=7426[avatar]TA获得超过360个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]11[view_count]
何谓分子杂交？核酸杂交技术的分子基础是什么？
分子杂交：将不同来源的DNA样品或DNA与RNA放在一起，热变性后使其缓慢地冷却，若这些异源的核酸分子之间在某些区段有相互补的顺序，在退火过程中会形成杂合的双链，这个过程称为分子杂交。核酸杂交技术的分子基本原理：是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双链螺旋分子称为杂交分子。核酸杂交技术的分子基础：杂交分子只有在种属比较近的物种之间才有可能形成。因为分类学上相近的生物，DNA分子往往具有某些相互补的碱基序列。
[create_time]2017-09-02 18:31:00[/create_time]2013-11-23 23:11:34[finished_time]2[reply_count]7[alue_good]TL181[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.bb4990bf.sMJMIsxtA_CPP6ot6GCmng.jpg?time=71&tieba_portrait_time=71[avatar]TA获得超过859个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]2755[view_count]核酸分子杂交在生活中有哪些应用
1、核酸分子杂交作为一项基本技术，已应用于核酸结构与功能研究的各个方面。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。
2、它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用，而且在临床诊断上的应用也日趋增多。
3、在医学上，目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断，恶性肿瘤的基因分析，传染病病原体的检测等领域。
4、在基因工程第三项目中，鉴定目的基因是否整合到染色体DNA上和鉴定目的基因是否准确表达蛋白质。
[create_time]2023-01-28 13:35:52[/create_time]2023-02-11 11:09:21[finished_time]1[reply_count]1[alue_good]王医师的健康笔记[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.97bb1bdf.ZQ5vnHw0aFiy6wonUkQIHw.jpg?time=7245&tieba_portrait_time=7245[avatar]TA获得超过131个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]97[view_count]
核酸分子原位杂交中杂交液的基本成分
核酸分子原位杂交中杂交液的基本成分：50%甲酰胺,ssDNA 100 μg/ml,探针20 ng,50 mmol/L DTT,5×Denhardt液,5%硫酸葡聚糖,4×SSC。阳离子可以极大提高核酸互补链的杂交效率；甲酰胺分子克隆第三版p510有详细的论述，用甲酰胺进行的杂交比通过调节温度更容易控制杂交的严谨性。提高核酸杂交率 - 溶液中含10%的硫酸葡聚糖，DNA链的再退火率约增加10倍，这一现象进一步扩大了单链或双链的探针与固定在膜上的DNA/RNA的杂交率。不仅如此，添加10%硫酸葡聚糖也许会增加随机切割的双链DNA探针与固定化核酸的杂交率，高达100倍。
[create_time]2012-04-12 14:10:46[/create_time]2012-04-12 16:32:03[finished_time]1[reply_count]5[alue_good]hehaihua2009[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.ed4128f7.eTmJB9Ewv0YcF5KyWCGx7A.jpg?time=2979&tieba_portrait_time=2979[avatar]TA获得超过2776个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]2138[view_count]
核酸杂交
懒得打字，贴。
核酸杂交方法是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）。经典的核酸杂交方法是将DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记，在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。
经典的核算杂交方法主要包括：DNA印迹杂交（Southern blot）RNA印迹杂交(Northern blot)以及斑点杂交和原位杂交：
1、 DNA印迹杂交（DNA blot hybridization）——有两种核酸印迹法：
将DNA或RNA溶液直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上（斑点或狭线印迹）
经琼脂糖凝胶电泳将片段的DNA或RNA转移到膜上（Southern和Northern印迹法）。DNA在电泳前先用限制性内切酶消化。
2、 RNA印迹杂交（RNA blot hybridization）：
RNA印迹杂交是一种检测已固定在滤膜上的总RNA或mRNA特定靶序列的技术。
3、 斑点杂交
将少量核酸样品点样在硝酸纤维素滤膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探针进行杂交。尼龙膜，特别是聚偏氟乙烯（PVDF）与DNA结合力更高，坚韧、易操作。点样可手工，也可用手工点样品。检测可用放射性探针自显影或非放射性探针显色。可用于DNA或RNA分析。
4、 原位杂交
在保持细胞形态条件下，进行细胞内杂交，显影或显色。可用于DNA或RNA分析。荧光原位杂交（FISH）进行染色体DNA分析可用于生物学研究的许多领域以及临床细胞遗传学研究。其主要优点是不仅可以在细胞分裂的中期，而且可在分裂间期核中诊断染色体的变化。
广义的核酸杂交就是指非同源的核酸分子间的复性（氢键结合）过程。因此可以说，目前的基因检测技术，除了质普法外都或多或少的涉及了核酸杂交原理。如PCR的引物复性过程、基因芯片的杂交检测过程、基因测序的引物复性过程以及各种SNP检测方法等等。
[create_time]2017-10-08 12:01:13[/create_time]2010-09-01 10:22:32[finished_time]3[reply_count]10[alue_good]浙大阿米巴[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.1df0e5d1.bAsYEfY6ztJVDZQz3D5yhQ.jpg?time=2957&tieba_portrait_time=2957[avatar]TA获得超过2.3万个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]5133[view_count]
何为dna的变性，复性和杂交？其影响条件以及分子遗传学应用意义有哪些
1.变性,这是DNA最重要的一个性质.
①DNA双链之间以氢键连接,氢键是一种次级键,能量较低,易受破坏,在某些理化因素作用下,DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂,使DNA双螺旋结构松散,变成单链,即为DNA变性.DNA变性只涉及二级结构改变,不伴随一级共价键的断裂.②监测DNA是否变性的一个最常用的指标是DNA在紫外区260nm波长处的吸收光值变化.因为DNA变性时,DNA双链发生解离,共轭双键更充分暴露,故DNA变性,DNA在260nm处的吸收光度值增加,并与解链程度有一定的比例关系,这种关系叫做DNA的增色效应.③DNA的变性从开始到解链完全,是在一个相当窄的温度内完成的,在这一范围内,紫外光吸收值增加达到最大增加值的50％时的温度叫做DNA的解链温度（Tm）.一种DNA分子的 Tm值的大小与其所含碱基中的 G＋C的比例相关也与DNA分子大小及变性条件有关,G+C的比例越高,DNA分子越长,溶液离子强度越高,Tm值越大.④加热、低盐及强酸、强碱均可使DNA变性.
2.复性
变性DNA在适当条件下,两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象,这种现象称为复性.热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性,这一过程也叫退火,一般认为,比Tm值低 25℃ 的温度是DNA复性的最佳条件.
3.DNA复性的实际应用——杂交：通过变性DNA的复性性质,我们可知道,DNA单链之间、RNA单链之间、一条DNA和一条RNA链之间只要存在序列互补配对区域,不管是整条链互补,还是部分序列互补,即可重新形成整条双链或部分双链,这即为核酸分子杂交,这在分子生物学研究中有极大的应用,比如：可用于在基因组中对特异基因的定位及检测,PCR技术扩增目的基因等,很多分子生物学实验技术应用的都是核酸分子杂交的原理,如Southern Blot,Northern Blot,包括PCR技术等.
[create_time]2022-05-30 01:21:46[/create_time]2022-06-07 07:45:03[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]大沈他次苹0B[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.268b9e4f._Pqr3QJiDoKzKAJr45bDew.jpg?time=4988&tieba_portrait_time=4988[avatar]TA获得超过6155个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]661[view_count]
发一个生化的知识点，DNA变性和复性核酸杂交
DNA的变性在极端的pH值(加酸或碱)和受热条件下，DNA分子中双链间的氢键断裂，双螺旋结构解开，这就是DNA的变性高色效应变性后的DNA在260nm的紫外光吸收增强，称为高色效应。在DNA变性中以DNA的热变性意义最大续表DNA的热变性又称DNA的解链或融解作用。在DNA热变性过程中，使紫外吸收达到最大增值50％时的温度称为解链温度，又称融解温度Tm)。Tm与DNA分子G+C量有关退火热变性的DNA溶液经缓慢冷却，两条解链的互补单链重新缔合，恢复双螺旋结构，即退火DNA的复性变性DNA经退火恢复原状的过程称变性DNA的复性低色效应伴随复性，DNA液紫外吸收减弱，称低色效应复性杂化不同来源核酸变形后，合并在一起，只要这些核酸分子含有可以形成碱基互补配对的序列，复性也可发生形成杂化双链，这个过程为杂化
★★★考点10：RNA主要分为信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖(核蛋白)体RNA(rRNA)三类。
mRNA mRNA为线状单链结构。大多数真核mRNA在5′端含倒装的7甲基三磷酸鸟苷(m7Gppp)，称为帽子结构。mRNA的3′末端有一段长短不一的多聚腺苷酸序列。3′末端的多聚腺苷酸结构可增加转录活性，增加mRNA稳定性。5′加“帽”、3′加“尾”属转录后加工过程tRNAtRNA均呈三叶草形状，这就是tRNA的二级结构。tRNA的三级结构为倒L型。tRNA二级结构有三个环，其中反密码环上有反密码子，反密码子辨认mRNA上相应的三联体密码，而且把正确的氨基酸连接到tRNA 3′末端的CCAOH结构上。由此可见tRNA在蛋白质生物合成中起运输氢基酸的作用续表rRNArRNA是细胞内含量最多的RNA。rRNA与核糖体蛋白共同构成核糖体。核糖体由大、小两个亚基组成。真核生物的核糖体小亚基由18SrRNA和30多种核糖体蛋白构成，大亚基则由5S、5.8S及28S三种rRNA与50种核糖体蛋白组成。当大小亚基聚合时，可作为蛋白质合成的场所 考点11：辅酶为结构复杂的小分子有机物，通过非共价键与酶蛋白疏松结合，可用透析、超滤等方法而分离；辅基则常以共价键与酶蛋白牢固结合，不易与酶蛋白分离。除了上述辅酶外，酶辅助因子主要是各种金属离子，如Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Na+和K+等。
酶蛋白辅助因子物质成分蛋白质非蛋白质结合特点一种酶蛋白只能结合一种辅助因子形成全酶一种辅助因子可与不同的酶蛋白结合形成不同的全酶参与反应催化一定的化学反应催化不同的化学反应特性决定反应的特异性决定反应的种类和性质 考点12：酶促反应的特点高效性、专一性、不稳定性、可调控性。
考点：酶的活性中心酶分子中能与底物结合并发生催化作用的局部空间结构称为酶的活性中心。活性中心中有许多与催化作用直接相关的基团，称为必需基团。有些必需基团涉及酶与底物的结合，又称为结合基团，有些具有催化功能，称为催化基团。在酶活性中心外，也存在一些与活性相关的必需基团。
[create_time]2020-09-20 10:44:16[/create_time]2020-10-05 10:27:18[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]环球网校[uname]https://iknow-pic.cdn.bcebos.com/9922720e0cf3d7ca4639f390f91fbe096a63a90d?x-bce-process=image/resize,m_lfit,w_900,h_1200,limit_1/quality,q_85[avatar]移动学习，职达未来！[slogan]环球网校成立于2003年,十多年来坚持“以学员为中心、以质量为本、以创新驱动”的经营理念,现已发展成为集考试研究、网络课程、直播课堂、题库、答疑、模考、图书、学员社区等为一体的规模化学习平台[intro]225[view_count]
